Laboratorní diagnostika - technologie dneška a zítřka

Laboratorní medicína se během posledních čtyřiceti let změnila z doplňkového oboru na zcela zásadního poskytovatele zdravotnické informace o pacientovi. Odborníci tvrdí, že se podílí na asi 70 % rozhodovacích klinických informací o pacientovi, a přitom náklady na tento segment činí přibližně 4 % z prostředků veřejného zdravotnictví. Současné technologie přinášejí obrovskou paletu nových testů, které jsou prováděny moderními analyzátory rychle, přesně a v obrovských objemech denně vyšetřených vzorků. Metody se přitom stále více automatizují, přístroje se zmenšují. Citlivost běžných, dnes používaných vyšetření je přirovnávána k měření koncentrací kostky cukru rozpuštěné v olympijském plaveckém bazénu a u řady metod molekulární PCR diagnostiky je ještě o několik řádů vyšší. Jak bude diagnostika vypadat v příštích letech?

Analyzátory se určitě budou dále zmenšovat, poroste jejich výkon i možnost použití mimo laboratoř zejména díky uplatnění nanotechnologií (pracujících s objekty velikosti tisíciny průměru lidského vlasu), ale i zcela nových kombinací již současných technik. Vynechme protentokrát předpovědi, zda budou dále vznikat stále větší nadregionální laboratorní celky, zda technologie a snaha o snižování nákladů způsobí další redukci personálu. Může to být i naopak – potřeba interpretace stále složitějších laboratorních nálezů, pro kterou bude kvalifikovaný personál nutný, zaměstnanost laboratorních pracovníků udrží. Podívejme se na příklady a přínos některých nových technologií, jejich nových kombinací a nových způsobů použití. Téma je to ale dnes již příliš široké, vybral jsem proto nesystematicky jen oblasti, které mne zaujaly.  

ZkumavkaSvatý grál laboratorní diagnostiky

Pokud bychom měli jmenovat oblast považovanou za svatý grál laboratorní diagnostiky, je to určitě spolehlivá neinvazivní diagnostika zhoubných nádorů ve velmi časných stadiích, které zůstávají dlouho, někdy i roky, neodhaleny. Pokud je nádor odhalen a léčen v časném stadiu, je léčba násobně účinnější. Současné screeningové programy již přinesly ohromné snížení mortality např. u nádorů prsu, děložního cervixu či kolorektálního karcinomu. Můžeme ale jít ještě dál, do velmi časných a preinvazivních stadií nádorového bujení? Řešení zřejmě může přinést právě laboratorní diagnostika. Potřebujeme test, který by spolehlivě zjistil nádor bez falešných pozitivit – tj. pozitivního výsledku testu tam, kde nádor není. A falešných negativit – neodhalený, již existující nádor. 
Úkol je to obrovský. Je známo, že tumorem způsobené změny DNA lze prokázat v plazmě nemocných jako cirkulující bezbuněčnou i v uvolněných buňkách přítomnou nádorovou DNA (též RNA, proteiny), která se u zdravých osob nevyskytuje („tekutá biopsie“). Možnost laboratorního využití bezbuněčné DNA, kterou řada solidních tumorů uvolňuje v časném stadiu vývoje z umírajících nádorových buněk do krevního oběhu, se v současné době zdá být efektivnější a snadněji automatizovatelná. Na rozdíl od odhalování třeba bakterií či virů, které mají jasně definovanou biologickou strukturu, jsou tumorem způsobené somatické změny ovlivněny řadou dalších faktorů. Solidní tumory jsou biologicky nesmírně různorodé ve své DNA, RNA, složení bílkovin a v dalších projevech (epigenetické změny). Ty se liší nejen mezi jednotlivými tkáněmi, ale i u daného typu tkáně. Vývoj a agresivita tumoru jsou navíc ovlivněny prostředím a imunitou organismu. Lze to přirovnat ke snaze diagnostikovat pestrou sbírku nemocí, které se liší i v průběhu jednoho a téhož onemocnění. Další komplikací je, že i zcela zdravé buňky produkují bezbuněčnou DNA – a tumorem změněné DNA, zvláště v časných fázích vývoje tumoru, je v tomto množství jen zlomek. Takže identifikovat specifický biomarker, který citlivě prokazuje jen jeden jediný typ nádoru, je krajně obtížné, natož snažit se o to u více nádorů jako obecný screening. Přece jen jde ale o nový přístup, který se liší od našich v současnosti používaných laboratorních biomarkerů ze séra či plazmy – nepřímých měření „náhražkových“ proteinů či metabolitů s nějakou výslednou pravděpodobností výskytu nádoru. Nově se sice jedná o identifikaci a měření nesmírného množství variací změněné DNA, ale přesto jde o PŘÍMOU DIAGNOSTIKU TUMORU a možnost SPECIFICKÉ DETEKCE. 

Pro takovéto porovnávání nezměněné a změněné DNA je zapotřebí mít pro každý typ nádoru klinická data stovek pacientů, navíc je nutné tyto pacienty dlouhodobě sledovat a vyřadit ze studie všechna data původně „zdravých“ pacientů, u kterých se po několika letech objevil nějaký typ nádoru. Konečným cílem diagnostiky je odlišit „signál“ zdravé buňky a jejích běžných klinicky nevýznamných mutací od prekancerózních změn a invazivních maligních změn (1). Dosáhnout odpovídající potřebný rozsah a hloubku sekvenace DNA i počítačového vyhodnocování je v současnosti ještě hodně drahé a málo automatizované. Velice efektivní jsou zde technologie mikročipů (microarrays). Microarray je molekulární ekvivalent excelovské tabulky, kde každá buňka na své adrese na čipu obsahuje definovanou prostorovou strukturu (třeba část jednovláknové DNA), na kterou se následně specificky váže jen odpovídající komplementární DNA struktura vzorku (přesně tam zapadne jako klíč do zámku). Vzorek může být předem nějakou barvičkou označený, takže pak přesně víme, jaké konkrétní struktury (třeba DNA) byly ve vzorku přítomny, protože víme, na které místo (buňku excelovské tabulky) se navázaly. Analýzu obrazu (obarvených buněk) pak provede počítač. Microarray může obsahovat desetitisíce nebo i milion „buněk excelovské tabulky“. Takováto neinvazivní charakterizace tumorové DNA kombinovaná s novými metodami zpracování velkých objemů komplexních dat technikami, které umožňují počítačovému systému „učit se“ (strojové učení), je již opravdu cestou k dosažení grálu – však také jedna z prominentních firem výzkumu na tomto poli se jmenuje 
„Grail, Inc.“. Zprávy o různých modifikacích těchto metod a nových testech odhalujících časná stadia přítomnosti konkrétních typů nádorů „z krve“ (např. melanomu a dalších) se už začínají objevovat i v denním tisku. Vyšetření cirkulující bezbuněčné DNA v těhotenství (v krvi matky se nachází i bezbuněčná DNA plodu) je dnes již rutinní neinvazivní metodou k odhalení případných genetických vad plodu. Další možnosti využití nachází cirkulující bezbuněčná DNA v diagnostice a sledování autoimunitních onemocnění, v traumatologii, u transplantací orgánů – aplikace se stále rozšiřují.

CRISPR-Cas a genová terapie

Zmapování odlišností tumorové DNA a „zdravé“ DNA bude přínosem i pro následné strategie zničení nádorových buněk – např. technikou CRISPR-Cas. Ta je schopna najít konkrétní zmutované místo v DNA a „molekulárními nůžkami“ jej „vystřihnout“. Tak by bylo možné narušit zmutované geny, ale z výše uvedeného je zřejmé, že se jedná o řadu různých změn struktury původní DNA, „zdravá“ DNA přitom zůstává nepovšimnuta a selektivně jsou zničeny jen nádorové buňky (2). Klinické zkoušky modifikovaného využití CRISPR imunoterapie nádoru na člověku již běží (Čína), první průkaznější výsledky lze snad čekat ještě v tomto roce (3). Techniku CRISPR-Cas lze použít i pro virem nakažené buňky (viry včleňují či přepisují svou genetickou informaci do DNA hostitele). Virem vnesenou část DNA lze touto technikou vyoperovat a na „ošetřené“ místo dát „záplatu“, která zároveň zabrání nové nákaze. Také lze změnit oblast, kterou virus používá ke vstupu do genetické informace hostitelské buňky (vstup pak již virus nenajde), nebo změnit – vytvořit supervýkonné vlastní imunitní buňky. To, že tyto principy fungují, bylo zatím prokázáno s částečnými úspěchy u různých virů včetně HIV, a to i na lidech (4). Také lze vytvořit senzor pro konkrétní virus. Během epidemie viru Zika se ukázalo, že řada nakažených měla jen jedinou kopii viru v jednom mikrolitru séra. Tak malé množství znamená pro diagnostiku velký problém. Využitím CRISPR-Cas metody je ale i takováto detekce viru možná, po navázání senzoru na konkrétní DNA/RNA sekvenci viru se objeví nějaký signál – například fluorescenční záření. Možnost takto manipulovat s genetickou informací (např. přesnou část vadného genu vyjmout a novou vložit) a tak ji upravovat – editovat ji – samozřejmě budí velké obavy a nastoluje mnohé etické otázky, které jsou pro medicínu zcela nové.

Hmotnostní spektrometrie

Odborníci předpokládají velký rozvoj této technologie v jejích pokročilých variantách. V EUC Laboratořích máme na oddělení mikrobiologie prvního zástupce – přístroj MALDI pro rychlou identifikaci bakterií. Principem je zacílení paprsku laseru na vzorek (s pomocnou matricí), což způsobí odpaření a ionizaci molekul vzorku. Ty jsou pak analyzovány v hmotnostním analyzátoru – po urychlení magnetickým polem proletí trubicí detektoru rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji, výsledkem je spektrum druhově specifické pro jednotlivé mikroorganismy. Varianty hmotnostní spektrometrie lze (dnes) použít i pro identifikaci různých proteinů, v genetice (identifikace oligonukleotidů, nukleových kyselin), steroidů, drog či vitaminu D.

Point-of-care (POCT) a home-testing technologie

Oblast laboratorních vyšetření v místě péče o pacienta – u lůžka, v ambulanci či doma – je jednou z nejrychleji se rozvíjejících technologií současnosti. Je směřována k maximální jednoduchosti provedení, vyšetření se většinou provádí přímo z plné krve, moči nebo slin. Nevýhodou oproti laboratorní diagnostice je často výrazně nižší kvalita stanovení, velký rozptyl naměřených výsledků – viz příklad obr. 1 u stanovení glukózy v krvi. Tyto testy však nelze podceňovat, je možné předpokládat, že technologické problémy budou vyřešeny a část laboratorní diagnostiky se sem z našich současných laboratoří přesune. Paleta těchto vyšetření, často prováděná i jako soubory vyšetření, se rozšiřuje každým dnem. Chtěl bych zde zmínit spíše zajímavá až kuriózní dnešní uplatnění těchto technologií, které ale zároveň ukazují jejich další potenciál. 

Pokud si přejete laboratorní analýzu s minimem odpadu, je zde rHEALTH® sensor (5), přístroj, který se vejde do dlaně a umožňuje rychlé počítání buněk krevního obrazu a biochemická vyšetření různých markerů z jedné kapky krve. Princip si můžeme představit jako běžný proužek na vyšetření moče chemicky, který se ponoří do moče a jednotlivá políčka se podle přítomnosti či chybění vyšetřovaných látek zbarví, či nikoli. U rHEALTH® sensoru je na proužku (nanostripu) zhuštěně naneseno množství tenkých mikronových reakčních linií. Přes nanostrip  je v přístroji pumpován vzorek krve a následně reagencie. Optika přístroje následně vyhodnotí fluorescenci jednotlivých reakčních linií proužku. Po propláchnutí lze nanostrip znovu použít. Nanostripy je možné v přístroji měnit a měnit tak paletu vyšetření. Tato revoluční technologie byla vyvinuta ve spolupráci s NASA, aby bylo možné monitorovat zdraví osádek vesmírných stanic a déletrvajících misí, ale uplatní se jistě i na Zemi. Komerční verze přístroje se v současnosti vyvíjí.  

Další zajímavostí je kupříkladu těhotenský test Clearblue® pro domácí použití, který ukazuje výsledek průkazu hormonu lidského choriového gonadotropinu (hCG) – již nikoli jako plus či minus znaménko, ale pro jasnou interpretaci přímo slovy na displeji kazetky jako „pregnant“ či „non pregnant“. Pokud toto již někdo nepovažuje za novinku, lze nabídnout další test Clearblue® – „pokročilý těhotenský test s odhadem týdnů těhotenství“ (Clearblue® Advanced Pregnancy Test with Weeks Estimator), který je dostupný třeba na Amazon.com. Test zjistí těhotenství a měří i hladinu hCG, ze které zpětně vypočítá, kolik týdnů proběhlo od poslední ovulace. Asi posledním výkřikem na poli těhotenských home-testů je First Response™ Pregnancy Pro. Vypadá jako běžný domácí těhotenský test – kazetka testeru, jejíž nasávací konec se ponoří do vyšetřované moče. Tenhle test ale k provedení potřebuje váš mobilní telefon. Nejprve si na mobilním telefonu otevřete aplikaci a vyplníte krátký dotazník – datum poslední menstruace, délku běžného cyklu apod. Poté se pomocí Bluetooth telefon spojí s testerem. Displej telefonu pak krok za krokem vede klientku v provedení vyšetření a ukazuje dobu do odečtení výsledku. Aby se při čekání na výsledek testu snížil stres, telefon se snaží klientku různě zabavit. Pak je třeba vložit do telefonu kód pro zabezpečené odeslání dat do vyhodnocovacího programu a výsledek s dalšími informacemi se objeví v okénku testeru i na mobilním telefonu. Vyhodnocovací program poskytuje i další informace a rady pro těhotenství. Test je dostupný na internetových portálech, konverzace je v angličtině (6). Kombinace testu s mobilní technologií, která je zaměřená na konkrétního klienta, jej vede skrze provedení testu a zároveň poskytne další nadstandardní informace a rady, ukazuje příští potenciál těchto aplikací. Obdobně využívá mobilní telefon např. POCT glukometr od f. Sanofi, pracuje se na chytrých kontaktních čočkách, které mohou měřit např. hladinu glukózy v „slzách“ či měřit nitrooční tlak s výsledky opět přenášenými na mobilní telefon.  

„Laboratoř na čipu“ (Lab-on-a-chip, LOC)

S výše popsanou snahou o časnou neinvazivní diagnostiku nádorů se překrývá a rozšiřuje obecné použití „laboratoře na čipu“, která slučuje a automatizuje různé laboratorní techniky a procesy do nanosystému, který je schopen zjistit řadu markerů různých onemocnění stejně jako plnohodnotná profesionální laboratoř, ale vejde se na destičku velikosti několika čtverečních centimetrů. Původně byl jako materiál destiček použit silikon a celý proces připomínal zpracování polovodičů na základní desce počítače, dnes se nejvíce používá speciální průhledný polymer a zcela nové mikro/nanotechniky zpracování. Metody využívají velmi malé objemy vzorků, regulované a řízené proudění roztoků skrze mikrokanálky s aplikací různých fyzikálních principů, dále mikro: pumpy, ventily, mixéry, dávkovače či senzory.  
Laboratoř na čipu představuje zmenšení více analytických přístrojů provádějících řadu automatizovaných laboratorních činností do jednoho čipu. Předpokládá se, že výroba čipů ve velkých počtech bude znamenat nižší ceny vyšetření – a to i díky nepatrným objemům reagencií, možnosti provádět řadu stanovení paralelně (jednotlivá patra čipu-mikrolaboratoře lze lepit na sebe jako plástve v úlu), mikroautomatizaci jednotlivých úkonů a úsporu původně lidské práce, vysokou rychlost a předpokládanou vysokou kvalitu stanovení i perspektivu dalšího rychlého rozvoje zejména v oblasti point of care (POCT) technologií. Molekulární nanodiagnostika již začíná expandovat mimo klasickou laboratoř. Příkladem jsou POCT testy firem Abbott, systém „Alere™ i“ a Roche „cobas® Liat® PCR System“ – obě firmy dodávají testy pro rychlou molekulární diagnostiku virů chřipky typů A a B, diagnostiku respiračně syncitiálního viru, streptokoka typu A (rychlý definitivní výsledek bez nutnosti ověřování negativních výsledků následnou kultivací), f. Roche nabízí ještě test pro detekci infekce Clostridium difficile). Velcí světoví výrobci diagnostických testů věnují těmto technologiím velkou pozornost. 
Mnoho odborníků se domnívá, že příštím cílem po „laboratoři na čipu“ bude „laboratoř uvnitř těla“, kdy čipy budou implantovány např. přímo v krevním oběhu a budou posílat zabezpečené výsledky do vašeho cloud computingu – společně s monitorem spánku, daty z chytrých hodinek apod. Vše pak posoudí v rámci IoT (Internet of Things), specializovaný počítačový program, který se stále učí s vývojem znalostí a techniky. Pak bychom již na onemocnění nemuseli reagovat většinou ex post a hledat příčinu, ale systém by měl varovat již při prvních známkách problémů a dát nám šanci zastavit onemocnění dříve, než se projeví či rozšíří. 

Skoro bych si řekl „to jsem si zapřeháněl“, ale pokud současné znalosti lidstva představují 1 % našich znalostí v roce 2050, tak možná zase tolik ne.

1. Aravanis,A.M. et al.: Cell, 168 (4), s. 571-574, 2017; 2. Aubrey B.J. et al.: Cell Reports, 10 (8), s. 1422-32, 2015; 3. Flavell,L: Immuno-Oncology News, April 27, 2018. Dostupné na internetu: https://immuno-oncologynews.com/crisprcas9-and-cancer/; 4. Liao H.K. et al. Nature Communications  6, s. 6413, 2015. Dostupné na internetu: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25752527; 5. Dostupné na internetu: https://www.rhealth.com/rhealth-technology/; 6. Dostupné na internetu: http://www.firstresponse.com/en/Products/Pregnancy/Pregnancy-PRO

MUDr. Petr Podroužek
MUDr. Petr Podroužek, CSc.

Po absolvování lékařské fakulty a získání atestací v oboru gynekologie-porodnictví a klinické biochemie pracoval do roku 2002 jako vedoucí Ústředních laboratoří Ústavu pro péči o matku a dítě v Praze 4-Podolí, gynekolog a řešitel řady výzkumných úkolů ústavu. Podílel se jako zakladatel na vzniku nestátních zdravotnických laboratoří AeskuLab, kde dlouhodobě zastával pozici ředitele. Ve vedení EUC Laboratoří pracuje od roku 2010, od roku 2017 je též členem odborné rady EUC.